Technika HRM umożliwia wykrywanie polimorfizmów i identyfikację fragmentów DNA różniących się długością, zawartością par GC lub sekwencją na podstawie krzywej denaturacji DNA bez stosowania specyficznych sond. Pozwala na identyfikacje delecji, insercji i substytucji, a także na detekcję pojedynczych podstawień nukleotydowych (np. SNP).

Pierwszym etapem analizy jest amplifikacja badanego fragmentu DNA, następnie denaturacja i powolna renaturacja w celu utworzenia heterodupleksu. W ostatnim etapie mieszanina zostaje poddana precyzyjnej denaturacji w obecności barwika interkalującego. Podczas powolnego schładzania poszczególne nici DNA hybrydyzują losowo. Hybrydyzacja niekomplementarnych nici prowadzi do utworzenia heterodupleksu. Niesparowane odcinki DNA posiadają niższą stabilność konformacyjną i tym samym denaturują w niższych temperaturach. Identyfikacja fragmentów DNA polega, podobnie jak w przypadku standardowej denaturacji DNA, na analizie krzywych topnienia. Delecje i insercje powyżej pięciu nukleotydów tworzą stabilne heterodupleksy i można je identyfikować również poprzez  standardową denaturację. W przypadku zmiany pojedynczych nukleotydów niezbędny jest system gwarantujący precyzyjną akwizycję sygnału fluorescencyjnego i niezwykle stabilną (co najmniej ±0.1°C) temperaturę.

Metoda HRM jest prostsza i znacznie tańsza od genotypowania opartego na znakowanych sondach, a także od czasochłonnych metod standardowych takich jak SSCP, DHPLC, RFLP. Reakcje amplifikacji i denaturacji przeprowadzane są w jednej  probówce, a wyniki otrzymywane w ciągu około 40-60 min w zależności od protokołu amplifikacji.

Metoda wykorzystywana jest między innymi do:

• Wykrywania mutacji punkowych/screening
• Genotypowania SNP/dyskryminacji alleli
• Identyfikacji gatunkowej
• Identyfikacji metylowanego DNA
• Analizy mikrosatelitów
• Stosowanie metody HRM znacznie ogranicza ilość fragmentów DNA poddawanych  sekwencjonowaniu dzięki wstępnej eliminacji  tych, które nie wykazują różnic w sekwencji.

Analiza SNP

Eco Real time PCR System może być wykorzystany do wykrywania wszystkich czterech znanych klas polimorfizmów SNP: (1) C/T i G/A  (2) C/A i G/T  (3) C/G  (4) A/T. Najtrudniejsze do identyfikacji są polimorfizmy klasy czwartej ze względu na najmniejsze różnice w temperaturze topnienia (<0.2 °C). Identyfikacja fragmentów odbywa się poprzez porównanie kształtów krzywych denaturacji oraz precyzyjne wyznaczenie temperatury topnienia poszczególnych fragmentów DNA.

Ze względu na specyficzną konstrukcję bloku, system posiada wyjątkowo dobrą równomierność rozkładu temperatury równą ±0.1 °Umożliwia to zastosowanie w aparacie techniki HRM bez konieczności programowej korekcji danych.   

Reakcja amplifikacji/analiza HRM

Analiza HRM powinna być poprzedzona wnikliwą analizą reakcji amplifikacji DNA. Zła wydajność amplifikacji DNA z reguły prowadzi do błędnej analizy HRM. Przed analizą HRM należy przeanalizować trzy podstawowe parametry amplifikacji: wartość Ct , końcową wartość fluorescencji oraz wydajność reakcji-

Pierwszym etapem analizy HRM jest normalizacja. Wymaga ona zdefiniowania linii podstawowej  przed- i po denaturacji tak, aby składała się z możliwie dużej ilości punktów, lecz nie zachodziła na region przejścia.

Normalizacja pozwala na porównanie krzywych denaturacji między sobą i automatyczną identyfikację genotypów na podstawie różnic w temperaturze topnienia (homozygoty) i kształtów krzywej denaturacji (heterozygoty). Krzywe zaliczane są do tego samego genotypu na podstawie wartości współczynnika procentowego.

Oprogramowanie Systemu Eco  pozwala także na przedstawienie wyników w postaci różnicy krzywych denaturacji wyznaczonej w stosunku do wybranej próby referencyjnej. Wykresy te dobrze ilustrują różnice w badanych próbach.