Podstawowym zastosowaniem systemu Odyssey jest ilościowa i jakościowa analiza membran wykonanych techniką Western blot oraz analiza ilościowa fluorescencji na mikropłytkach, w tym analiza wyników, uzyskanych dzięki zastosowaniu technik immunocytochemicznych (In-cell Western oraz On-cell Western). W przeciwieństwie do chemiluminescencji oraz fluorescencji w zakresie promieniowania widzialnego, detekcja w podczerwieni daje możliwość precyzyjnej i powtarzalnej analizy ilościowej membran i mikropłytek, znacznie szerszy zakres pracy liniowej oraz niezwykle stabilny sygnał fluorescencyjny. Membrany mogą być analizowane nawet kilka miesięcy po wykonaniu eksperymentu. Szeroki zakres liniowy umożliwia analizę zarówno słabych jak i intensywnych pasm na jednej membranie. Otrzymany obraz jest wyraźny i ostry, bez efektu rozmycia charakterystycznego dla techniki chemiluminescencyjnej w przypadku naniesienia zbyt dużej ilości materiału. Ponadto, rejestracja i analiza obrazu nie wymaga kłopotliwej pracy w ciemni, a zastosowanie detekcji w zakresie podczerwieni znacznie ogranicza całkowite koszty eksperymentu (IR vs. Chemi Cost Comparison).

Zalety detekcji w podczerwieni

Większość oferowanych fluorescencyjnych systemów analizy obrazu pracuje w widzialnym zakresie promieniowania, w którym membrany oraz polimery stosowane do produkcji mikropłytek wykazują wysoką autofluorescencję oraz tendencję do rozpraszania światła. Wysoka fluorescencja tła, w znacznym stopniu ogranicza czułość systemu i powoduje, że wykrywanie białek występujących w komórkach w niskich stężeniach jest praktycznie niemożliwe.

System Odyssey pracuje w zakresie podczerwieni, w którym rozpraszanie wiązki oraz autofluorescencja są bardzo ograniczone. W związku z tym, aparat rejestruje obraz, w którym poziom fluorescencji tła jest bardzo niski a tym samym, stosunek sygnału do szumu jest znacznie większy niż w przypadku aparatów pracujących w zakresie światła widzialnego. Wynikiem tego jest niezwykle wysoka czułość systemu.

CHEMILUMINESCENCJA: Dwukrotne rozcieńczenia        ludzkiej transferryny identyfikowanej techniką Western blot. Zastosowano królicze przeciwciała pierwszorzędowe anty-Tf oraz przeciwciała drugorzędowe znakowane HRP.	ODYSSEY: Dwukrotne rozcieńczenia ludzkiej transferryny identyfikowanej techniką Western blot. Zastosowano królicze przeciwciała pierwszorzędowe anty-Tf oraz przeciwciała drugorzędowe znakowane and IRDye®

Jednoczesna detekcja w  dwóch niezależnych kanałach

Odyssey jest system dwukanałowym, umożliwiającym jednoczesną detekcję dwóch różnych białek na tej samej membranie. Nie jest to możliwe w przypadku systemów rejestrujących reakcje chemiluminescencyjne lub wykorzystujących przeciwciała znakowane radioaktywnie. Dwukanałowa detekcja daje możliwość bezpośredniego porównania stężeń dwóch różnych białek na tej samej membranie i tym samym znacznie ułatwia proces normalizacji wyników. Ponadto, eliminuje błędy związane z płukaniem żeli i ponownym wiązaniem przeciwciał w celu identyfikacji drugiego białka na tej samej membranie. Możliwość poprawnej normalizacji wyników zwiększa dokładność analizy ilościowej oraz jej powtarzalność.

System jednocześnie rejestruje fluorescencję pochodzącą od dwóch różnych barwników. Jako źródła wzbudzenia, zastosowano dwa niezależne lasery emitujące fale o długościach różniących się o 100 nm (685 oraz 785 nm), dzięki czemu zminimalizowano wzajemny wpływ kanałów pomiarowych i wyeliminowano konieczność programowej korekcji danych. Do rejestracji emitowanej fluorescencji wykorzystano detektory półprzewodnikowe. Dzięki zastosowaniu laserów oraz wzbudzaniu każdego barwnika promieniowaniem o długości odpowiadającej jego maksimum absorpcji, uzyskano niezwykle wysoką czułość systemu.

Analiza ilościowa i szeroki zakres detekcji

Dzięki innowacyjnemu zastosowaniu przeciwciał znakowanych barwnikami fluorescencyjnymi uzyskano szeroki zakres pracy liniowej aparatu umożliwiający detekcję i analizę zarówno niskich jak i wysokich stężeń białek na jednej membranie lub mikropłytce. Ponadto, sygnał fluorescencyjny jest stabilny przez długi okres, dzięki czemu membrany mogą być analizowane nawet kilka miesięcy po wykonaniu eksperymentu.

Dynamiczny charakter reakcji chemiluminescencyjnej pozwala jedynie na rejestrowanie „migawkowych zdjęć". Otrzymane wyniki w dużym stopniu zależą od ustawień czasowych i stopnia naświetlenia membrany lub mikropłytki, co bardzo ogranicza zakres liniowy oraz dostarcza jedynie jakościowych lub półilościowych wyników.

Dokładność i liniowość systemu Odyssey daje pewność, że wyznaczone różnice w stężeniach białka są realne, a nie spowodowane jedynie różnymi warunkami pomiaru. Membrany mogą być przechowywane bez dostępu światła i jeśli istnieje taka konieczność, analizowane ponownie po upływie nawet kilku miesięcy.

Dwukrotne, seryjne rozcieńczenia przeciwciał (6 ng do 0.19 ng) naniesiono na nitrocelulozę. Po przeprowadzeniu analizy ilościowej wyznaczono współczynnik regresji liniowej R². W zakresie od 3.0 ng do 0.37 pg wynosi on 0.998, co wskazuje na bardzo dobrą liniowość nawet w niskim zakresie stężeń.

Bardzo szerokie zastosowanie

Podstawowym zastosowaniem systemu Odyssey jest ilościowa i jakościowa analiza membran wykonanych techniką Western blot oraz analiza ilościowa fluorescencji na mikropłytkach. Ponadto, system może służyć między innymi do analizy żeli barwionych fluorescencyjnie lub CoomassieÒ, analizy Northern Blot i Southern blot, a także wyników uzyskanych dzięki zastosowaniu technik immunocytochemicznych (In-Cell Western oraz On-cell Western). Poniżej, przedstawione są przykłady zastosowań systemu wraz z dostępnymi publikacjami oraz informacjami przedstawionymi w formie seminariów internetowych.

Obrazowanie in vivo

Odyssey może również zostać zastosowany do badań obiektów in vivo. Przeznaczona do tego celu przystawka MousePOD, umożliwia przyżyciową rejestrację fluorescencji organów wewnętrznych trzech myszy, umieszczonych w termostatowanej komorze, zamontowanej nad polem skanującym aparatu. Myszy są poddawane anestezji za pośrednictwem stożkowych maseczek, podłączonych do zewnętrznego źródła gazu usypiającego. Dla ułatwienia analizy wyników, opracowano specjalny programowy moduł SAI, dostarczany wraz z przystawką.

Oprogramowanie

Oprogramowanie systemu Odyssey zostało opracowane we współpracy z jego użytkownikami na całym świecie. Dzięki temu, stworzono intuicyjny program, oferujący wszystkie najbardziej zawansowane funkcje oraz metody analizy jakościowej i ilościowej. Umożliwia on między innymi: automatyczną i ręczną detekcję ścieżek i pasm, obliczanie mas cząsteczkowych i współczynników migracji (Rf), korekcję zniekształceń poziomych i pionowych rozdziału, dowolne definiowanie obszaru analizy (elipsa, koło itd.), odejmowanie tła obrazu, obliczanie intensywności pasm, obliczanie stężeń w odniesieniu do próby wzorcowej oraz porównanie profili pochodzących z dwóch kanałów poprzez nałożenie ich na jednym wykresie. Mikropłytki mogą być analizowane przy użyciu szablonów siatkowych, dających możliwość zdefiniowania obszarów do analizy ilościowej. Dane zebrane w formie tabel i wykresów mogą zostać zapisane lub wysłane w postaci raportu.

Barwniki do detekcji i odczynniki

Oprócz niskiego poziomu fluorescencji tła kluczowe znaczenie mają barwniki stosowane do detekcji. Firma LI-COR Biosciences jest liderem w stosowaniu fluoroforów w zakresie podczerwieni do detekcji makrocząsteczek. Oferujemy unikatową grupę barwników IRDye zawierających reaktywne grupy funkcyjne, które umożliwiają tworzenie wiązań kowalencyjnych z przeciwciałami lub innymi makrocząsteczkami, a także szeroki wybór drugorzędowych przeciwciał znakowanych barwikami fluorescencyjnymi IRDye, bufory blokujące oraz membrany do techniki Western blot przystosowane do detekcji fluorescencji

Specyfikacja techniczna

Okres użytkowania lasera: zwykle 40.000 godzin

Źródło lasera kanału 700: Laser diodowy półprzewodnikowy dla 680 nm

Źródło lasera kanału 800: Laser diodowy półprzewodnikowy dla 780 nm

Detektory: fotodiody lawinowe

Prędkość skanowania: 5-40 cm/s

Rozdzielczość: 21-337 mm 

Warunki robocze: 15-35°C i temperatura punktu rosy nie większa niż 20°C

Wymagania dotyczące mocy: Automatyczny wybór napięcia w zakresie 90-250 VAC /47-63 Hz; pobór mocy < 200 watów

Wymiary: 37 wys. x 53 szer. x 58 gł. cm (14,5 x 21 x 23 cali)

Ciężar: 33 kg

Protokół sieciowy: TCP/IP

Podłączenie sieciowe: Kat. 5 RJ-45, 10 Base-T/100 Base-TX

Zabezpieczenie: Dostęp chroniony hasłem

Certyfikat CE