Odyssey® Loading Indicators - pomocniczy odczynnik w procesie normalizacji

• Odyssey 28 KD Loading Indicator – 800 nm, 2 x 1 mL [P/N 926-20002]     ULOTKA
  

• Odyssey 28 KD Loading Indicator – 700 nm, 2 x 1 mL [P/N 926-20004]

Opis

Odyssey Loading Indicator (OLI) umożliwia szybkie i łatwe określenie powtarzalności nanoszenia próbek na kolejne ścieżki żelu, a także sprawdzenie jednorodności transferu białek w procesie Western blot. Wskaźniki  Odyssey Loading Indicator  to pojedyncze rekombinowane białka o masie 28 kDa znakowane bezpośrednio za pomocą barwników fluorescencyjnych NIR.  Dostępne są dwie wersje odczynnika, jedna emitująca w zakresie 700, druga zaś w zakresie 800 nm

Dla porównawczej i ilościowej analizy Western blot istotne jest nanoszenie  równej ilości próbek na poszczególne ścieżki żelu. Poprzez aplikację identycznych ilości Odyssey Loading Indicator do każdego dołka, można sprawdzić, czy nie wystąpiły różnice wynikające z błędu popełnionego podczas pipetowania .

OLI mogą być także pomocne w sprawdzeniu stabilności ekspresji białek referencyjnych, a co z tego wynika, do oceny ich przydatności w normalizacji Western blot.

Uwaga: Prawidłowa normalizacja polega na stosowaniu wewnętrznej kontroli procesu, z  zastosowaniem endogennego białka jako wskaźnika stężenia próbki. Ponieważ OLI jest białkiem egzogennym, może służyć wyłącznie jako zewnętrzna kontrola ładowania oraz źródło informacji odnośnie stabilności ekspresji białka użytego jako kontrola wewnętrzna.

Zmienność procesu transferu może zasadniczo wpłynąć na jakość wyników ilościowej analizy Western blot. W celu sprawdzenia jednorodności przenoszenia białek z żelu na membranę należy użyć kontroli nanoszenia, zastosowany w tym celu OLI pomoże ujawnić zaburzenia powodowane przez pęcherzyki oraz inne niekorzystne  zjawiska występujące w zakresie 28 kDa.

W przypadku stosowania do normalizacji Western blot białka referencyjnego, należy sprawdzić, czy jego ekspresja jest stała we wszystkich próbkach i czy nie podlega wpływowi warunków eksperymentalnych.  Jako białko egzogenne, OLI nie zmienia się w wyniku czynności, jakim poddawana jest próbka  i może służyć do sprawdzenia, czy zmiany poziomu białka referencyjnego nie wynikają z wadliwego sposobu nanoszenia próbek.

"Białka referencyjne nie powinny być używane do normalizacji bez sprawdzenia, czy warunki eksperymentu nie wpływają na ich ekspresję."

   Journal of Biological Chemistry, wymagania dla autorów

A) OLI i białka referencyjne, kanał 800 nm	(B) REVERT™ Total Protein Stain, kanał 700 nm

Rysunek 1. Detekcja OLI 800.

(A) Odyssey Loading Indicator (OLI) rejestrowany jednocześnie z białkami referencyjnymi, COX IV i tubuliną, w kanale 800 nm systemu Odyssey CLx .

(B) REVERT Total Protein Stain rejestrowany w kanale 700 nm. Białka badane w lizacie  komórek Jurkat, poddanemu różnym poziomom działania etopozydu.

Rysunek 2. Ocena  ekspresji tubuliny i COX IV za pomocą OLI.

Wykresy przedstawiają sygnały rejestrowane dla białka referencyjnego, oraz OLI i REVERT Total Protein Stain. Sygnały (A) tubuliny  i (B) COX IV

zmieniająsię w funkcji działania etopozydu, podczas gdy dla  REVERT Total Protein Stain oraz OLI pozostają niezmienione. Przytoczone dane

ilościowe dowodzą zmian ekspresji białek referencyjnych  pod wpływem działania etopozydu.

Rysunek 3. Stały sygnał Odyssey Loading Indicator oraz COX IV.

Komórki Jurkat zostały potraktowane wzrastającymi ilościami TPA, stymulującego pERK (linia pomarańczowa, 800 nm).

OLI (linia zielona, 800 nm) zostałużyty do oceny stabilności ekspresji białka referencyjnego COX IV (linia niebieska, 700 nm).

Odchylenia standardowe dla trzykrotnych powtórzeń pomiarówprzedstawiono w formie słupków.