Odyssey^® F - laserowy system detekcji i analizy obiektów fluorescencyjnych NIR/VIS^*

 ^{*zakres VIS dostępny wylącznie w 10-kanałowym modelu 9180}

Podstawowym zastosowaniem systemu Odyssey^® F jest ilościowa i jakościowa analiza membran wykonanych techniką Western blot oraz analiza ilościowa fluorescencji na mikropłytkach, w tym analiza wyników, uzyskanych dzięki zastosowaniu technik immunocytochemicznych (In-Cell-Western oraz On-Cell-Western). W przeciwieństwie do chemiluminescencji oraz fluorescencji w zakresie promieniowania widzialnego, detekcja w podczerwieni daje możliwość precyzyjnej i powtarzalnej analizy ilościowej membran i mikropłytek, znacznie szerszy zakres liniowości zapisu oraz niezwykle stabilny sygnał fluorescencyjny. Membrany mogą być analizowane nawet kilka miesięcy po wykonaniu eksperymentu. Szeroki zakres liniowy umożliwia analizę zarówno słabych jak i intensywnych pasm na jednej membranie. Otrzymany obraz jest wyraźny i ostry, bez efektu rozmycia charakterystycznego dla techniki chemiluminescencyjnej w przypadku naniesienia zbyt dużej ilości materiału. Ponadto, rejestracja i analiza obrazu nie wymaga kłopotliwej pracy w ciemni, a zastosowanie detekcji w zakresie podczerwieni znacznie ogranicza całkowite koszty eksperymentu:

  Systemy obrazowania Odyssey F powstały jako następcy doskonale znanego aparatu Odyssey Dlx oferując dzięki zastosowaniu skanowania liniowego dwa razy większą szybkość rejestracji niż ich poprzednik, zachowując przy tym jego wszystkie zalety. Model dwulaserowy 9150 , podobnie jak Odyssey Dlx umożliwia wzbudzenie fluorescencji w dwóch zakresach NIR, dodatkowo zapewniając rejestrację w trzech kanałach wzbudzenie/emisja. Badacze używający w swych eksperymentach fluorescencji w widzialnym zakresie widma zechcą zapewne wybrać 10-kanalowy model Odyssey 9180 wyposażony w dodatkowe lasery 488 i 520 nm oraz odpowiednie filtry emisyjne.

Zalety detekcji w podczerwieni

Większość oferowanych fluorescencyjnych systemów analizy obrazu pracuje w widzialnym zakresie promieniowania, w którym membrany oraz polimery stosowane do produkcji mikropłytek wykazują wysoką autofluorescencję oraz tendencję do rozpraszania światła. Wysoka fluorescencja tła, w znacznym stopniu ogranicza czułość systemu i powoduje, że wykrywanie białek występujących w komórkach w niskich stężeniach jest praktycznie niemożliwe.

System Odyssey^® F 9150 pracuje w zakresie podczerwieni, w którym rozpraszanie wiązki oraz autofluorescencja są bardzo ograniczone. W związku z tym, aparat rejestruje obraz, w którym poziom fluorescencji tła jest bardzo niski a tym samym, stosunek sygnału do szumu jest znacznie większy niż w przypadku aparatów pracujących w zakresie światła widzialnego. Wynikiem tego jest niezwykle wysoka czułość systemu.

CHEMILUMINESCENCJA: Dwukrotne rozcieńczenia ludzkiej transferryny identyfikowanej techniką Western blot. Zastosowano królicze przeciwciała pierwszorzędowe anty-Tf oraz przeciwciała drugorzędowe znakowane HRP.	ODYSSEY: Dwukrotne rozcieńczenia ludzkiej transferryny identyfikowanej techniką Western blot. Zastosowano królicze przeciwciała pierwszorzędowe anty-Tf oraz przeciwciała drugorzędowe znakowane and IRDye®

Jednoczesna detekcja w dwóch niezależnych kanałach

Odyssey^®  F jest system wielokanałowym, umożliwiającym jednoczesną detekcję różnych białek na tej samej membranie. Nie jest to możliwe w przypadku systemów rejestrujących reakcje chemiluminescencyjne lub wykorzystujących przeciwciała znakowane radioaktywnie. Dwukanałowa detekcja daje możliwość bezpośredniego porównania stężeń dwóch różnych białek na tej samej membranie i tym samym znacznie ułatwia proces normalizacji wyników. Ponadto, eliminuje błędy związane z płukaniem żeli i ponownym wiązaniem przeciwciał w celu identyfikacji drugiego białka na tej samej membranie. Możliwość poprawnej normalizacji wyników zwiększa dokładność analizy ilościowej oraz jej powtarzalność.

System jednocześnie rejestruje fluorescencję pochodzącą od różnych barwników. Jako źródła wzbudzenia  w trzykanałowym modelu 9150 zastosowano dwa niezależne lasery emitujące fale o długościach różniących się o 100 nm (685 oraz 785 nm), dzięki czemu zminimalizowano wzajemny wpływ kanałów pomiarowych i wyeliminowano konieczność programowej korekcji danych. Do rejestracji emitowanej fluorescencji wykorzystano detektory półprzewodnikowe. Dzięki zastosowaniu laserów oraz wzbudzaniu każdego barwnika promieniowaniem o długości odpowiadającej jego maksimum absorpcji, uzyskano niezwykle wysoką czułość systemu.

Analiza ilościowa i szeroki zakres detekcji

Dzięki innowacyjnemu zastosowaniu przeciwciał znakowanych barwnikami fluorescencyjnymi uzyskano szeroki zakres pracy liniowej aparatu umożliwiający detekcję i analizę zarówno niskich jak i wysokich stężeń białek na jednej membranie lub mikropłytce. Ponadto, sygnał fluorescencyjny jest stabilny przez długi okres, dzięki czemu membrany mogą być analizowane nawet kilka miesięcy po wykonaniu eksperymentu.

Dynamiczny charakter reakcji chemiluminescencyjnej pozwala jedynie na rejestrowanie „zdjęć migawkowych". Otrzymane wyniki, w dużym stopniu zależą od ustawień czasowych i stopnia naświetlenia membrany lub mikropłytki, co bardzo ogranicza liniowy zakres rejestracji oraz dostarcza jedynie jakościowych lub półilościowych wyników.

Precyzja i liniowość rejestracji systemu Odyssey daje pewność, że wyznaczone różnice w stężeniach białka są rzeczywiste, a nie spowodowane jedynie różnymi warunkami pomiaru. Membrany mogą być przechowywane bez dostępu światła i jeśli istnieje taka konieczność, analizowane ponownie po upływie nawet kilku miesięcy.

Dwukrotne, seryjne rozcieńczenia przeciwciał (6 ng do 0.19 ng) naniesiono na nitrocelulozę. Po przeprowadzeniu analizy ilościowej wyznaczono współczynnik regresji liniowej R2. W zakresie od 3.0 ng do 0.37 pg wynosi on 0.998, co wskazuje na bardzo dobrą liniowość nawet w niskim zakresie stężeń.

Bardzo szerokie zastosowanie

Podstawowym zastosowaniem systemu Odyssey^®  jest ilościowa i jakościowa analiza membran wykonanych techniką Western blot oraz analiza ilościowa fluorescencji na mikropłytkach. Ponadto, system może służyć między innymi do analizy żeli barwionych fluorescencyjnie lub Coomassie, analizy Northern Blot i Southern blot, a także wyników uzyskanych dzięki zastosowaniu technik immunocytochemicznych (In-Cell Western oraz On-cell Western). Przykłady zastosowań systemu wraz z dostępnymi publikacjami oraz informacjami, przedstawione zostały w języku angielskim w formie seminariów internetowych na stronie producenta Odyssey F Applications

Obsługa za pomocą jednego przycisku.

Oprogramowanie sterujące LAS, wspólne dla Odyssey^® M, Odyssey^® F i Odyssey^® XF umożliwia szybki i łatwy zapis obrazów oraz ich katalogowanie.

W połączeniu z aparatami rodziny Odyssey^® umożlwia ono rejestrację następujących obiektów:

• Western blot – metody chemiluminescencyjne, emitujące fluorescencję w zakresie NIR, również w wersji multiplex
• DNA w żelach agarozowych barwionych SYTO^® 60 DNA
• białka w żelach poliakryloamidowych barwione Coomassie
• testy w płytkach wielodołkowych ( np. In-Cell Western™)
• EMSA
• preparaty mikroskopowe

Barwniki do detekcji i odczynniki

Oprócz niskiego poziomu fluorescencji tła kluczowe znaczenie mają barwniki stosowane do detekcji. Firma LICORbio  jest liderem w stosowaniu fluoroforów w zakresie podczerwieni do detekcji makrocząsteczek. Oferujemy unikatową grupę barwników IRDye^® zawierających reaktywne grupy funkcyjne, które umożliwiają tworzenie wiązań kowalencyjnych z przeciwciałami lub innymi makrocząsteczkami, a także szeroki wybór drugorzędowych przeciwciał znakowanych barwnikami fluorescencyjnymi IRDye^®, bufory blokujące oraz membrany do techniki Western blot przystosowane do detekcji fluorescencji.