REVERT^™ Total Protein Stain

 

• REVERT™ Total Protein Stain Kit [P/N 926-11010]                                  
  
• REVERT™ Total Protein Stain, 100 mL [P/N 926-11011]                          
  
• REVERT™ Wash Solution, 200 mL [P/N 926-11012]                                  
  
• REVERT™ Reversal Solution, 200 mL [P/N 926-11013]                             
  
• REVERT™ Total Protein Stain and Wash Solution Kit [P/N 926-11015]  
  

 

Opis

REVERT Total Protein Stain Kit przeznaczony jest do barwienia  20 miniblotów i zawiera:

• 1 x 100 mL REVERT Total Protein Stain
• 1 x 200 mL REVERT Wash Solution
• 1 x 200 mL REVERT Reversal Solution

 

Zestaw REVERT Total Protein Stain służy do przeprowadzenia wiarygodnej i dokładnej normalizacji Western blot. Metoda ta umożliwia określenie całkowitej ilości białka przetransferowanego  z żelu na membranę z zachowaniem liniowości w szerokim zakresie stężeń próbek.

 

• Szybko. Wybarwienie białek na membranie nitrocelulozowej lub PVDF zajmuje mniej niż 10 minut.

• Dokładnie . Dzięki zachowaniu liniowości w przedziale 1-60 µg, możliwa jest detekcja REVERT oraz badanego białka  w tym samym zakresie stężeń.

• Wiarygodnie.W odróżnieniu od białek referencyjnych, na precyzję normalizacji za pomocą REVERT nie ma wpływu biologiczna zmienność próby odnośnikowej.

• Szybko i bez niekorzystnych interakcji. REVERT Total Protein Stain nie wymaga używania specjalnych żeli  i może być łatwo wprowadzony do stosowanego wcześniej procesu Western blot. Barwienie trwa krócej niż 10 minut i może być prowadzone dla próbek na membranach nitrocelulozowych i PVDF

 

Rysunek 1. Szybkie barwienie za pomocą REVERT Total Protein Stain. REVERT Total Protein Stain umożliwia niezwykle wydajne barwienie białek na membranach celulozowych lub Immobilon-FL PVDF w czasie poniżej 10 minut. Po naniesieniu na każdą ze ścieżek po 10 µg lizatu komórek Jurkat  prowadzono rozdział w 4-12% gradiencie NuPAGE (Bis-Tris). Po przetransferowaniu na membranę nitroce-lulozową oraz PVDF, obraz rejestrowano za pomocą systemu Odyssey® CLx w kanale 700 nm.

 

Dokładna normalizacja

Dzięki skorygowaniu różnic, powstałych pomiędzy ścieżkami podczas nanoszenia i transferu badanych białek, REVERT umożliwia precyzyjną normalizację wyników analizy ilościowej Western blotów.  REVERT Total Protein Stain zachowuje liniowość w szerszym zakresie stężeń lizatów komórkowych, niż powszechnie stosowane białka referencyjne (housekeeping proteins).

(Rysunek 2).

 

A

Rysunek 2. REVERT Total Protein Stain wykazuje liniowość w szerszym zakresie niż białka referencyjne Liniowość metody ma zasadnicze znaczenie dla analizy ilościowej.  Powyżej 20 µg lizatu komórkowego, białka ulegają wysyceniu i nie wykazują liniowej korelacji pomiędzy ilością i sygnałem. REVERT zachowuje liniowość w  zakresie od 1 do 60 µg lizatu komórkowego. Lizat komórek był rozdzielany w 4-20% gradiencie żelu Tris-glicyna, a następnie transferowany na membrany PVDF. Przedstawione wartości względnej fluorescencji są średnimi, uzyskanymi w wyniku trzech powtórzeń pomiarów.

 

 

REVERT^™ Total Protein Stain – schemat procesu

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Często zadawane pytania (FAQ)

 

Czy blot należy barwić za pomocą REVERT™ Total Protein Stain przed, czy po wysuszeniu membrany ?

REVERT może być zastosowany na membranie mokrej lub wysuszonej po transferze.  W przypadku suchej membrany należy ją przez barwieniem krótko namoczyć w wodzie. Membrany     PVDF należy przed namoczeniem spłukać metanolem.

 

Czy można ponownie użyć REVERT Total Protein Stain?

REVERT jest przeznaczony do jednorazowego użytku i nie zaleca się jego używania do barwienia kolejnych membran. Powtórne użycie odczynnika wpływa niekorzystnie na dokładność normalizacji.

 

Czy REVERT może zakłócać wiązanie przeciwciał lub wpływać na detekcję białka oznaczanego za pomocą Western blot? 

REVERT jest kompatybilny z wszystkimi procedurami immunodetekcji Western blot i nie interferuje z procesem wiązania przeciwciał.

 

Jak czuły jest REVERT?

REVERT wykazuje liniowy zakres detekcji od 1 do 60 µg dla lizatów komórkowych. Poszczególne białka mogą być wykrywane z czułością na poziomie nanogramów. 

 

Po zastosowaniu  REVERT, nie są widoczne efekty bawienia pasm

Możliwe powody :

1. Kiepska jakość transferu. Należy sprawdzić jak przetransferowały się markery mas cząsteczkowych.
2. Membrana nie została spłukana wodą przed barwieniem.
3. Nie dodano metanolu do Stain Solution.

 

W wyniku barwienia REVERT powstaje wysokie tło. Jak temu zaradzić?

Przed użyciem dodać do Stain Solution 30 ml metanolu.

 

Jak przechowywać REVERT Total Protein Stain i jaki jest jego czas przydatności do użycia?

REVERT Total Protein Stain przechowywany w temperaturze pokojowej zachowuje swoje własności przez 6 miesięcy do daty dostarczenia.

 

Czy można ciąć i poddawać kolejnej detekcji Western bloty barwione za pomocą REVERT?

Tak, membrana może być inkubowana z kolejnymi przeciwciałami, połączonymi z chromoforem rejestrowanym w kanale 800 nm.

 

Czy można użyć  REVERT dla blotu poddanego wcześniej inkubacji z kolejnymi przeciwciałami?

Ponieważ sygnał uzyskany w wyniku barwienia takiego blotu będzie znacznie osłabiony, nie zaleca się używania REVERT w zastosowaniu do kilkukrotnie inkubowanych membran.

 

Czy można zastosować REVERT po zablokowaniu membrany?

Nie, ponieważ  REVERT wybarwi również związane przez membranę białka buforu blokującego. Emitowany przez nie sygnał istotnie zakłóci detekcję białek w próbie.

 

Czy sygnał REVERT Total Protein Stain może być rejestrowany przez systemy innych producentów?

Najlepsze rezultaty zapewniają systemy Odyssey^® zaprojektowane specjalnie do rejestracji w zakresie NIR, można jednak stosować także inne aparaty umożliwiające detekcję fali o długości 700 nm. Można również użyć systemów rejestrujących w zakresie światła białego, licząc się jednak ze znacznym zredukowaniem liniowości i zakresu dynamicznego zapisu.